伴刀豆球蛋白A中铽(III)和钴(II)之间的能量转移一种新的金属离子之间距离的探针

关键词：伴刀豆球蛋白A，铽离子，钴离子，离子探针

基于Forster偶极一偶极无辐射能量转移机理估测溶液状态下能量给予体和接受体之间的距离已广泛应用于生物大分子的构象分析中，但仍局限于有机物基团之间的距离测定。Horrocks等人用铽和钴离子作为探针测定了嗜热菌蛋白酶分子内一个钙离子与锌离子之间的距离，测定结果与x-光衍射结果相吻台。铽是钙的有效受光探针，钴能占据Con—A中锰离子的位置。本文利用铽和钴为探针，估测了Con—A中两金属离子结台位置之间的距离。

一、理论基础

按照Forster偶极一偶极无辐射能置转移机理，能量给体与受体间转移效率E与真实距离r和临界距离R0有下列关系：

消光系数，单位是(mol/L)^-1cm^-1，d是波数，单位是cm^-1。

能量转移效率E由下式测定：

二、材料与方法

1．仪器与试剂

日本Hieach Model-850荧光光谱仪，日本岛津UV-365型紫外-可见-近红外分光光度仪，伴刀豆球蛋白A：生化试剂，中国科学院上海药物研究所制品。其它试剂均为分析纯。

2．试剂的处理

试剂的处理及探针溶液的制备同文献[10]。

三、结果与讨论

1．铽(Ⅲ)与Con-A配合比的确定

向脱离子的Con-A溶液中逐渐加入氯化铽(Ⅲ)的溶液，在荧光仅上观测545nm处铽(Ⅲ)的敏化特征荧光强度。铽的与[Tb^3+]/[Con-A]的变化关系如图1．由图1可见[Tb^3+]/[Con-A]达到1：1时，铽的敏化荧光强度不变。结果表明每个Con-A单体中仅结合1个铽(Ⅲ)离子。

脱离子Coa-A浓度为0．037mmol／L，0．1mol／L的六次甲基四胺一盐酸缓冲溶液，pH一6．7，0．1mol／L的氯化钠，加入铽的最终浓度为0．138mmol／L．激发波长Ex=296·0nm。

2．钻对Con-A结合铽(III)的荧光淬灭

向Con-A铽(III)配合物的溶液中滴加氯化钴溶液，铽的荧光强度逐渐降低，如图2。在伴刀豆球蛋白A中钴(Ⅱ)进入锰(Ⅱ)的结合位置，则钴对铽的荧光淬灭是能量转移淬灭。

3．Com-A中钙(II)与锰(Ⅱ)之间距离的确定

由锰(Ⅱ)在Con-A中的配位环境，选择了3：1的乙酰丙酮和钴(Ⅱ)配合物为模型化合物。光谱的重迭见图3，由图3应用方程(3)计算重迭积分为2．16×10^-12cm2(mol／L)^-1。折射指数取水的折射指数n=l.33。K^2取各向同性因子2/3。给予体铽(III)的量子产率的测定比较复杂，环境对此影响比较大，实验测定的铽(III)的量子产率为D=0．25。将上述数值代人方程(2)可得转移效率为50％时的临界距离置R0=6.82A，由方程(4)测定E=0．67，由方程(1)可得r=6．0A。

4．讨论

估测的Con-A中两离子结合拉置间的距离与x-光晶体衍射的结果r=0．6A有些差别。这一结果有两方面的因素，其一可能是晶体状态与溶液状态分子的空间构象不完全相同；其二可能是测量过程中有误差。虽然结果有些差别，但作为近似距离的估算也是有意义的。总之，这一技术研究溶液状杰下生物大分子的微区结构，方法简便，药品用量少，可以朴偿X-衍射方法的不足之处。

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